Question

【题目】酵母菌的蛋白质可作为饲料蛋白的来源，有些酵母菌能以工业废甲醇作为碳源，研究人员拟从土壤样品中分离出可利用工业废甲醇的酵母菌，这样既能减少污染又可变废为宝。下图为主要操作流程示意图。

回答下列问题：

（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的____，及时对培养基进行分装，并进行高压蒸汽灭菌：在加热排除高压锅内原有的____后，将高压锅密闭，继续加热，通常在____的条件下，维持15-30min，可达到良好的灭菌效果。

（2）取步骤②中梯度稀释后的适量液体加入无菌培养皿，然后将高压蒸汽灭菌后的培养基冷却至____（25℃/50℃/80℃）左右时倒入培养皿混匀（步骤⑧），冷凝后将培养皿倒置，在适宜的条件下培养一段时间。

（3）挑取平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线纯化，下列叙述合理的是____。

a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌

b．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量

c．划线时不能划破培养基表面，以确保能正常形成菌落

d．第二区以后的划线起始端要与上一区的划线的末端相连接，最后一区的划线末端不能与第一区的划线相连

（4）步骤⑤的培养中，应加入 ___作为碳源，并加入适量的氮源、无机盐和水等成分。为监测发酵罐中酵母菌活细胞的密度，取2mL发酵液稀释1000倍后，加入等体积台盼蓝染液染色，用如图所示的计数室规格为25x16型的血细胞计数板计数，要达到每毫升4x109个活酵母菌细胞的预期密度，理论上，图中标号①～⑤五个中格里的呈____色的酵母菌细胞总数应不少于____个。

Answer 1

【答案】pH 冷空气 （压力为）100kPa、（温度为）121℃ 50℃ a、c、d 工业废甲醇 无 40

【解析】

1、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。

②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。

2、分析题图：①称量土样，里面含有需要分离的酵母菌；②表示梯度稀释和涂布平板；③④表示平板划线法，进行纯化培养；⑤表示扩大培养，获得更多的酵母菌。

（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量、溶化，调节培养基的pH，及时对培养基进行分装，高压蒸汽灭菌。在加热排除高压锅内原有的冷空气后，将高压锅密闭，继续加热，通常在（压力为）100kPa、（温度为）121℃的条件下，维持15-30min，可达到良好的灭菌效果。

（2）倒平板需要将培养基冷却至50℃进行。

（3）a、接种针、接种环使用前都必须灭菌，做到无菌操作，a正确；

b、挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中，而不是细胞内甲醇的含量，b错误；

c、划线时应避免划破培养基表面，否则大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，c正确；

d、第二区域以后的划线区域的菌种来源于上一区域的末端，所以第二区以后的划线起始端要与上一区的划线的末端相连接，并且最后一区的划线末端不能与第一区的划线相连，d正确，以便于分离菌落。

故选acd。

（4）本实验的目的是分离出可利用工业废甲醇的酵母菌，所以应该以甲醇作为碳源，活细胞膜具有选择透过性，经等体积台盼蓝染液染色，无色细胞才计数；为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，达到每毫升4×109个活细胞的预期密度，则n÷80×400÷（0.1×103）×2000=4×109，则5个中方格中无色酵母菌不少于40。