Question

【题目】钙依赖蛋白激酶（CDPK）在植物的信号传导和提高植物抗性方面发挥着重要作用，科学家通过将CDPK基因导入拟南芥中，来获得具有抗性的新品种。下图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图，图中标记了限制酶的切割位点。回答下列问题。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_______________，为了使CDPK基因插入质粒中，应选取________________两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段。

（2）将获取的CDPK基因进行PCR扩增，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶主要原因是_____________________________________。

（3）图中所示的质粒为Ti质粒，操作过程中需要把CDFK基因插入到质粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在转化中的作用是____________________________。为了检测CDPK基因是否导入成功，可以用________________________________作探针检测CDPK基因是否导入拟南芥细胞，导入成功的标志是________________ 。

（4）为研究CDPK基因表达载体对拟南芥的遗传转化的影响，将转化后的拟南芥植株生长成熟后，采集其种子，播种于含________________________的MS培养基中进行抗性筛选。

（5）基因工程的核心是_________________ ，目的是 ____________________________。

Answer 1

【答案】基因组文库和cDNA文库 XbaⅠ和SmalⅠ Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 T-DNA片段能携带CDPK基因整合到受体细胞的染色体DNA上 放射性同位素标记的含有CDPK基因的DNA片段 显示出杂交带 卡那霉素 基因表达载体的构建 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①应用DNA分子杂交技术检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②应用分子杂交技术检测目的基因是否转录出了mRNA；③应用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）基因文库包括基因组文库和cDNA文库，为了使CDPK基因插入质粒中，选择XbaⅠ和SmalⅠ能够将目的基因完整切下，并且在质粒的T-DNA片段中也有切点，而HindⅢ会影响目的基因的完整度，EcoRⅠ会破坏标记基因。
（2）将获取的CDPK基因进行PCR扩增，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。
（3）图中所示的质粒为Ti质粒，操作过程中需要把CDFK基因插入到质粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在转化中的作用是T-DNA片段能携带CDPK基因整合到受体细胞的染色体DNA上；为了检测CDPK基因是否导入成功，可以用放射性同位素标记的含有CDPK基因的DNA片段作探针检测CDPK基因是否导入拟南芥细胞，导入成功的标志是显示出杂交带。
（4）为研究CDPK基因表达载体对拟南芥的遗传转化的影响，将转化后的拟南芥植株生长成熟后，采集其种子，播种于含卡那霉素的MS培养基中进行抗性筛选，能成活的植株就是成功转基因的拟南芥植株。
（5）基因工程的核心是基因表达载体的构建 ，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。