限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，在质粒上有该酶的一个切点。　　　　　　　（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

（2）质粒的化学本质是            ，可以作为哪一种基因操作工具？         。

（3）要将用限制性内切酶Ⅰ切开的质粒与已经修饰好的目的基因连接起来，需要用到的基因操作工具是           ，该工具能将两个DNA分子末端的        和        连接起来，形成重组DNA分子的骨架。

基因工程相关。2008年诺贝尔化学奖授予了三位在研究绿色荧光蛋白（GFP）方面做出突出贡献的科学家。绿色荧光蛋白能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，这样借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。下图为我国首例绿色荧光蛋白（GFP）转基因克隆猪的培育过程示意图，据图回答：

注：图中通过过程①、②形成重组质粒，需要限制性内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—^↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

  （1）在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来        ，理由是：                                          。

  （2）过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多的方法是              。

  （3）如果将切取的GFP基因与抑制小猪抗原表达的基因一起构建到载体上，GFP基因可以作为基因表达载体上的标记基因，其作用是               。获得的转基因克隆猪，可以解决的医学难题是，可以避免           。

  （4）目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：          （用数字表示）。①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）④表达出蓝色荧光蛋白。

基因工程中，外源DNA片段常用PCR方法扩增，扩增后需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。下表列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

（1）含目的基因的外源DNA片段用PCR方法扩增时使用DNA聚合酶，其不同于一般生

物体内DNA聚合酶的最主要特点是　 ▲　 。PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图1为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？　 ▲　 。

（2）图2中的质粒和含目的基因的外源DNA构建重组质粒，一般不只用AluⅠ一种酶切割，原因是　 ▲　 。

（3）图2中获取的重组质粒时运用了　 ▲　 限制酶切割，切割后的质粒与目的基因片段混合，加入了　 ▲　 酶，该酶是对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？　 ▲　 。

（4）重组质粒导入受体细胞后，通常要进行检测。若要检测目的基因是否转录出mRNA，可用　 ▲　 技术；若要检测目的基因是否表达出蛋白质，可用　 ▲　 技术。

在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要（  ）

  ①DNA连接酶  ②同一种限制性内切酶   ③RNA聚合酶    ④具有标记基因的质粒

  ⑤目的基因     ⑥四种脱氧核苷酸

A．③⑥     B．②④     C．①⑤          D．①②④