35.（7分）棉铃虫是一种危害棉花的害虫。我国科学工作者发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而这种毒蛋白对人畜无害。通过基因工程方法，科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并成功表达，棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡。花粉管通道法是指：利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，进而导入尚不具备细胞壁的合子或早期胚细胞，最终形成含有目的基因的种胚。此种方法的优点是操作简便，省去了组培的复杂过程。

（1）利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因操作的基本步骤中的第三步，即                  。构建基因表达载体时要把目的基因整合到Ti质粒的T-DNA上，其原因是                    。

（2）基因工程的工具酶可以将目的基因切下并连接到运载体上。限制酶可以识别特定的DNA序列，并切断         键。下列所示的黏性末端是由         种限制酶作用产生的。

（3）用标记的特异性抗体可以直接检测毒蛋白，这种检测方法称为                 。

也可在宏观性状水平检测该目的基因是否表达，方法是                  。已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞                 。

 棉铃虫是一种危害棉花的害虫。我国科学工作者发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而这种毒蛋白对人畜无害。通过基因工程方法，科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并成功表达，棉铃虫食用了这种转基因棉花的植株后就会造成死亡。花粉管通道法是指：利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，近而导入尚不具备细胞壁的合子或早期胚体细胞，借助天然的种胚系统，形成含有目的基因的种胚。

（1）下列所示的黏性末端是由____________种限制性内切酶作用产生的。

（2）利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因操作的基本步骤中的第________步，即__________________________。导入植物细胞的方法除花粉管通道法外还有_______________，_______________ 。

（3）为减少获得目的基因的盲目性，在获得真核生物的目的基因时，应尽量采用__________________的方法。

（4）该目的基因在导入受体细胞前需要与运载体结合，目前经常使用的运载体有：___________、_____________和_______________。

（5）检测该目的基因是否表达的方法是_________________________________。

棉铃虫是一种危害棉花的害虫。我国科学工作者发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而这种毒蛋白对人畜无害。通过基因工程方法，科学家采用花粉粒通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并成功表达，棉铃虫食用了这种转基因棉花的植株后就会造成死亡。花粉粒通道法是指：利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，近而导入尚不具备细胞壁的合子或早期胚体细胞，借助天然的种胚系统，形成含有目的基因的种胚。回答下列相关问题：

（1）下列所示的黏性末端是由_______________种限制性内切酶作用产生的。

（2）利用花粉粒通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因操作的基本步骤中的第________步，即___________________________________。为减少获得目的基因的盲目性，在获得真核生物的目的基因时，应尽量采用_________________________的方法。

（3）该目的基因在导入受体细胞前需要与运载体结合，目前经常使用的运载体有：

________________、_________________和__________________。

（4）检测该目的基因是否表达的最简便方法是__________________________________。