研究人员利用基因工程技术对肺癌的治疗进行了大量研究，肺部细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图所示，据图回答

1.在基因工程中通常选择细菌质粒作为载体，原因是                          ；如果某质粒由100 0个脱氧核苷酸组成，脱氧核苷酸平均分子量为a,则该质粒的质量为        。

2.图甲中在构建重组载体时，酶切目的基因和酶切质粒时，所用的限制酶可以不同，但是产生的粘性末端必须是                。

3.图甲中在将酶切后的目的基因导入到酶切后的质粒上时需要的酶是              ， 图乙中let-7基因转录过程需要的酶是    ，这 两种酶作用的化学键都是          。

4.EcoR I限制酶只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端。                      

5.原代培养是是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。原代培养随着培养时间的延长和细胞不断分裂，空间因素和营养因素会限制其进一步生长。此时就需要将培养物分割成小的部分（组织细胞分散开），重新接种到另外的培养器皿内再进行培养，这个过程就称为传代或者再培养。图甲中进行传代培养操作时，需要用　　 　　酶处理贴附在原代培养培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。

6.研究发现，let-7基因能影响RAS基因的表达，其影响机理如图乙所示。从分子水平的角度分析，其作用机理是　　                               　    　。

7.下图所示pBR322是目前常用的人工质粒载体。如果将BamHI处理后的pBR322质粒与用BgIⅡ处理得到的目的基因进行重组，并将重组质粒导入原本无amp^R和tet^R  的大肠杆菌进行培养。为了检测重组质粒是否成功导入大肠杆菌，现将上述大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是___       _____ ，图三结果显示，多数大肠杆菌内导入的是___            __。

目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

（1）建构基因表达载体时，必须有               、复制原点、目的基因、终止子以及                                    。

（2）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于                    。

（3）pBR322分子中有单个EcoRI限制酶作用位点，EcoRl只能识别序列—GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRl的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端                   。

（4）pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复         ，成功获得了重组质粒。说明                         。

（5）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落；再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是            。图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是                 。

（15分）基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”构建过程如下：
第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。
第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入neoR（新霉素抵抗基因）等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样，将表达载体准确地带到靶基因的位置。
第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。
第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。
请根据上述资料，回答下列问题：
（1）在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成                。
（2）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是            ；若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为            细胞。
（3）上述资料中neoR基因的作用最可能是            。
（4）获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因            。

（15分）基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”构建过程如下：

第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。

第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入neoR（新霉素抵抗基因）等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样， 将表达载体准确地带到靶基因的位置。

第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。

第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。

请根据上述资料，回答下列问题：

（1）在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成                 。

（2）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是             ；若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为             细胞。

（3）上述资料中neoR基因的作用最可能是             。

（4）获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因             。

基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”构建过程如下：

第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。

第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入neoR（新霉素抵抗基因）等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样， 将表达载体准确地带到靶基因的位置。

第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。

第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。

请根据上述资料，回答下列问题：

（1）在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成                 。

（2）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是             ；若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为             细胞。

（3）上述资料中neoR基因的作用最可能是             。

（4）获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因             。