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    【题目】（一）图（a）中的三个 DNA 片段上依次表示出了 EcoRI、BamHI 和 Sau3AI 三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的 EcoRI、Sau3AI 的切点是唯一的）

    根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

    （1）经 BamHI 酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 _______________酶切后的产物连接。

    （2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组质粒，如图（c）所示。这三种重组质粒中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_______________。不能表达的原因是___________。

    （3） DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，它作用对象是 ________键。

    （二）丝素蛋白是家蚕的一种分泌性复合蛋白，由丝素蛋白重链（FibH）、丝素蛋白轻链（Fibl）和 P25 糖蛋白组成。将 Fibl 基因导入大肠杆菌（不含质粒 A）并实现表达的过程如图所示。

    ①构建重组质粒时要用到的工具酶是________________。

    ②接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌，有的不能形成菌落，原因是____________。

    ③影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上，轻 轻印一下，再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。经培养后，比较新平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置，推测可能导入了重组质粒的菌落是 ____________（用字母表示）。

    ④目的基因成功表达的标志是_______________。

    【答案】Sau3A I 甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。 磷酸二酯键 限制酶和DNA连接酶 没有导入质粒 b、c 大肠杆菌合成丝素蛋白轻链

    【解析】

    1．基因工程技术的基本步骤：

    （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．

    （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．

    （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．

    （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

    2．基因工程的工具：

    （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。

    （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

    （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。

    3.DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链。

    （一）（1） 由于限制酶Sau3A I与BamHI切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3A I酶切后的产物连接。

    （2）启动子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子也是一段有特殊结构的DNA短片段，相当于一盏红色信号灯， 使转录在所需要的地方停止下来。在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。而甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。

    （3）DNA 连接酶能催化两个 DNA 片段之间的磷酸二酯键形成。

    （二）①构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶。

    ②接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌，有的不能形成菌落，说明对氨苄青霉素不具有抗性，而导入成功的大肠杆菌都表现出对氨苄青霉素的抗性，故大肠杆菌不能长出菌落的原因是因为没有导入质粒。

    ③由图可知，a、b、c、d都是对氨苄青霉素有抗性的大肠杆菌，说明都是成功导入质粒的大肠杆菌，图中显示重组质粒中的四环素抗性基因被破坏，故导入重组质粒的大肠杆菌不具有对四环素的抗性，故在含有四环素培养基上生长的菌落是导入质粒A的大肠杆菌，即图中的a、d，b、c菌落没有长出，说明这两个菌落不具有对四环素的抗性，故b、c可能是导入重组质粒的大肠杆菌。

    ④题中的目的基因是Fibl 基因，而目的基因表达成功的含义是控制形成了相应的蛋白质，故本题中目的基因成功表达的标志是大肠杆菌合成丝素蛋白轻链。

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    限制酶

    EcoR V

    Sau3AI

    BamH I

    识别序列及切割位点




    （1）据图分析，为便于过程①所获得的目的基因片段能够顺利与质粒P连接，需要在目的基因片段加上__________序列。成功导入P1的受体菌落具有的抗药性特点为__________。

    （2）过程③用到的酶为__________。为了保证目的基因能够正常表达，在构建P1时需要将目的基因插入__________之间。

    （3）科学家最早就是利用基因工程方法在大肠杆菌和酵母菌细胞内获得了干扰素，利用大肠杆菌作为受体菌的优点是____________________。以大肠杆菌为受体细胞时通常用人特定细胞的mRNA为材料来获得cDNA，其原理是______________________________。

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