1.转化：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.构建：以质粒作载体为例

第三步：将目的基因导入受体细胞

1.构成：目的基因+启动子+终止子+标记基因

(1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能启动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

(2)终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端，终止基因的转录。

(3)标记基因：一段特殊的基因序列，主要是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素基因。

2.目的基因的获取方法：

　 从供体细胞直接提取--主要是原核生生物基因

　 从基因文库中获取

　 利用mRNA反转录形成

　 利用PCR扩增技术

　 人工化学法合成

3PCR技术扩增目的基因

(1)原理：DNA复制

(2)过程：加热至90-95℃DNA解链→冷却到55-60℃，引物结合到互补DNA链→加热至70-75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建

第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因

3.“分子运输车”--载体

(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

(2)最常用的载体是­­质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的环状DNA分子。

(3)其它载体：噬菌体、动植物病毒

2.“分子缝合针”--DNA连接酶

(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T_4-DNA连接酶)的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E·coliDNA连接酶来源于T₄噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T₄DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同:­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

1.“分子手术刀”--限制性核酸内切酶(限制酶)

(1)来源：主要是从微生物中分离纯化出来的

(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式即黏性末端和平末端。

3.技术支持

　 基因转移载体的发现

　 工具酶的发现

　 DNA合成和测序技术的发现

　 DNA体外重组的实现

重组DNA表达实验的成功

第一例转基因动物的问世

　PCR技术的发明

2. 理论基础

　DNA是遗传物质的证明

　 DNA双螺旋结构和中心法则的确立

遗传密码的破译